基因编辑动物净化之——基因型鉴定

　　各位童鞋，考考你们基因工程小鼠成功繁育之后应该做什么呢?

　　机智的你们一定能想到是基因型鉴定啦!

　　基因型鉴定在基因工程小鼠应用中不可或缺，在很多同学眼里这可能是一项基础性的工作，但实际上里面有N多小细节需要注意，下面就由小编带你一起get小鼠基因型鉴定吧!

　　一、小鼠尾基因组DNA的制备

　　提到基因型鉴定，脑海中是不是闪现出“鼠尾DNA提取 PCR”的关键词呢?

　　没错，鼠尾基因组DNA的制备是基因型鉴定的第一步，也是整个实验中至关重要的步骤，其中有很多容易忽视的地方需要我们注意哦!

　　1. 样本准备

　　在基因型鉴定中，小鼠基因组DNA的制备是决定实验结果好坏的关键。根据经验，一般选择在小鼠出生3-4周剪尾。

　　注意：① 鼠尾尾尖(<5mm)可获得的DNA量足够用于基因型鉴定。

　　② 剪鼠尾的剪刀每剪完一次需用酒精棉擦拭，避免DNA交叉污染。

　　③ 避免鼠尾样本带有血液。

　　2. DNA抽提

　　1)将鼠尾剪碎，离心管中加入500uL裂解液和适量15 uL蛋白酶K(10 mg/mL)。

　　2)样本浸于溶液中并充分振荡混匀，置于55℃恒温加热仪。

　　3)加入500uL DNA提取饱和酚和500uL核酸提取液，12000 rpm离心10 min，离心后将上清液转移至新离心管中。

　　4)上清中加入1mL无水乙醇(约2倍体积)，上下轻晃，直至出现絮凝的DNA沉淀，8000 rpm离心3 min，弃上清。

　　5)加75%的酒精1mL洗涤，12000 rpm离心5 min，弃上清，留沉淀，倒置干燥5 min。

　　6)加入200 µL DEPC水(可根据DNA量调节)，使沉淀完全溶解，于-20℃保存备用。DNA 样品的 OD260/280 在 1.8-2.0 之间。

　　注意：① 需要充分裂解鼠尾，样本应消化至肉眼看不到大颗粒为止。

　　② DNA模板浓度应控制在50-100ng/ul进行PCR。

　　二、PCR

　　成功的PCR扩增产物不仅需要高质量、标准浓度的DNA，根据产物GC的含量还需要选择合适的PCR酶。在基因工程小鼠鉴定中，使用常规的PCR酶不一定能得到好的结果，往往需要用到特殊的PCR酶，一般在定制的基因工程小鼠鉴定方案中会指出适合的PCR酶。

　　让我们一起看看基因工程小鼠的鉴定方案吧~

双转基因小鼠基因型鉴定方案
Primer	Sequence 5' --> 3'			Primer Type
oIMR1644	5'-AATAGAGAACGGCAGGAGCA-3'			Transgene
oIMR1645	5'-GCCATGAGGGCACTAATCAT-3'			Transgene
42	CTAGGCCACAGAATTGAAAGATCT			Internal Positive Control Forward
43	GTAGGTGGAAATTCTAGCATCATCC			Internal Positive Control Reverse
PCR Reaction System	Reaction Conponent			Volum（μL）
	10X Buffer			2.5
	ddH2O			16.75
	Primer			1
	Primer			1
	Mg2+			2
	dNTPs			0.5
	Taq			0.25
	Template			1
	Total			25
	phanta Max from Takara
Cycling Reaction	Step	Temp	Time	Cycle
	1	95	5min
	2	95	30sec
	3	60-65	30sec
	4	72	40sec	Goto step 2, 40 cycles
	5	72	5min
	6	10	Hold
Gentype	TG：608bp Control：324bp