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Cre小鼠和Flox小鼠的使用，你真的搞清楚了吗？
Q1：什么是Cre小鼠和Flox小鼠？
Cre小鼠通常指携带Cre重组酶表达元件的基因工程小鼠。Cre重组酶来源于噬菌体P1，能特异性识别loxP位点并介导位点特异性重组。根据构建方式不同，Cre品系可分为随机转基因、敲入型和诱导型（如CreERT2）等；在转基因设计中，Cre基因通常受组织特异性启动子调控，从而实现其在特定组织、细胞或时间窗口的条件性敲除或表达。
Flox小鼠指在目标基因关键外显子或调控区域两侧插入了loxP位点的基因工程小鼠。loxP位点作为Cre重组酶的识别序列，一般情况下其插入本身不影响目标基因的正常转录与功能。当与表达Cre重组酶的小鼠杂交时，Cre酶可介导两个loxP位点间的基因重组，从而实现目标基因的条件性敲除或激活。
Q2：Cre/Loxp系统工作原理
LoxP位点是一段34bp的特异性DNA序列，由两个13bp的反向重复序列（作为Cre重组酶的识别区域）和一个8bp的非对称间隔序列（决定重组方向性）组成。
根据基因组中LoxP位点的相对位置和方向，Cre重组酶可介导以下三种不同的重组事件：
① 缺失：loxP位点的方向相同，Cre酶介导两者之间的DNA片段缺失。
② 倒位：loxP位点方向相反，Cre酶介导片段的倒位（翻转）。
③ 易位：loxP位点在不同染色体或远端区域：Cre酶介导片段的交换（基因易位）。
Q3：Cre小鼠与Flox小鼠的配繁
通过将Cre小鼠与Flox小鼠杂交，可获得同时携带Cre重组酶基因和Flox目标基因的子代小鼠。典型条件敲除繁育中，通常先获得Cre/+；flox/+子代，再与flox/flox个体回交，以获得Cre/+；flox/flox实验鼠及相应同窝对照。
▲条件性基因敲除小鼠的繁育路线
Q4：Cre小鼠和Flox小鼠的应用
A. 实现基因敲除：当Cre酶在特定组织、细胞类型或时间点表达时，与Flox小鼠配繁后可实现特定组织或发育阶段的基因敲除；若采用广泛表达或胚系表达的Cre品系，则可用于获得全身性敲除，或将floxed等位基因转化为重组后的缺失等位基因。
B. 基因功能研究：利用组织特异性基因敲除，通过比较基因敲除后特定组织器官的表型变化，可精确解析基因的生理功能及其调控网络。
C. 建立疾病模型：通过模拟人类疾病的特定遗传突变，可建立基因型-表型对应的疾病动物模型，为疾病机制研究和药物筛选提供有力工具。
Q5：Cre小鼠使用常见问题解析
A.Cre小鼠一般怎么鉴定？
① 常规Cre鉴定多采用Cre特异性PCR引物，用于判断个体是否携带Cre元件。需要注意的是，通用Cre引物通常只能判定“Cre阳性/阴性”，并不能直接区分所有品系的纯合/杂合状态。
② 对于随机转基因构建的Cre工具鼠，常规PCR多用于判断是否携带Cre转基因；是否能够进一步区分拷贝状态，需以该品系的官方鉴定方案为准。
③ 对于敲入型Cre工具鼠，通常可通过野生型等位基因与敲入等位基因特异性PCR区分+/+、Cre/+等基因型；具体引物组合、扩增片段大小和判读标准应以该品系官方资料或鉴定方案为准。
B.Flox小鼠配了Cre小鼠后仍然检测到目的蛋白，怎么回事？
该类问题涉及的因素较多，常见的原因有以下几点：
① 基因型判断错误■ 需确认小鼠为Flox纯合子（Flox/Flox）且Cre阳性（Cre/+）■ 避免使用Flox杂合子（Flox/+），防止未重组等位基因表达
② 抗体特异性不足■ 若抗体识别的表位位于未删除区域，或存在非特异结合/交叉反应，可能出现“仍检测到目的蛋白”的假象。■ 建议结合已验证的小鼠源单克隆抗体、阴性对照，并同时检测mRNA水平、蛋白大小及可能的蛋白异构体。
③ Cre介导重组效率不足■ 不同Cre品系、不同目标位点以及不同组织或发育阶段的重组效率可能存在明显差异。■ 建议在目标组织或细胞层面通过qPCR或测序验证重组效率。
④ 组织纯度不足■ 检测组织中可能混入Cre不表达的细胞。■ 可结合显微解剖、流式分选或其他细胞富集方法，提高检测样本的纯度。
⑤ 蛋白残留或检测时间过早■ 即使DNA已发生重组，目标蛋白也可能因半衰期较长而在一定时间内仍可检测到。■ 对于诱导型系统（如CreERT2），还应充分考虑诱导方案以及诱导后至取材之间的时间窗口是否足够。
C.如何提高Cre小鼠的重组效率？
Cre重组效率主要与Cre表达的强弱、需要重组的flox区域大小以及基因座的敏感性相关。
因此在实际使用中，建议优先选择已有文献和数据库充分表征的Cre/iCre品系；先与报告鼠交配验证组织特异性和重组谱；在目标组织中同时进行重组PCR、mRNA和蛋白三级验证；对于诱导型CreERT2系统，还需优化诱导剂量、频次和取材时间。
斯莱克景达Cre工具鼠资源
| 动物品系 | 编号 | 功能 | ||
| H11-mcherry | T-0006 | 该品系在小鼠H11位点敲入mCherry荧光基因，可稳定、高效地在全身组织中表达mCherry，便于活体成像、细胞示踪及基因功能研究等可视化分析。 | ||
| lyz2-Cre | T-0007 | 该品系利用lyz2基因启动子驱动Cre重组酶表达，可在巨噬细胞和中性粒细胞等髓系细胞中特异性敲除含LoxP序列的靶基因，广泛应用于先天免疫及炎症相关研究。 | ||
| Alb-Cre | T-0008 | 该品系在Alb基因启动子控制下表达Cre重组酶，可在肝实质细胞中特异性敲除含LoxP序列的基因，常用于肝脏疾病模型及肝脏特异性基因功能研究。 | ||
| Villin-Cre | T-0009 | 该品系以小鼠Villin基因启动子驱动Cre重组酶在肠上皮细胞中表达，可对携带LoxP序列的目标基因进行肠上皮特异性敲除，广泛应用于消化道生理和病理研究。 |
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